Tehnicile de secvențiere a ADN-ului, viitorul medicinei personalizate

Secvențierea ADN-ului a revoluționat cercetarea biologică și medicală, fiind pregătită să aibă un impact similar în medicină. Secvențierea genelor implică etape precum pregătirea și identificarea mostrelor în baza de date, secvențierea și analiza datelor. Noile tehnici de secvențiere revoluționează identificarea elementelor implicate într-o multitudine de boli umane și generează o mulțime de informații relevante din punct de vedere medical, despre fiecare persoană, ca bază a medicinei personalizate a viitorului.

Genomurile sunt decodate într-un singur test rapid, care oferă un diagnostic mai precis al bolii, pentru a ajuta la tratament. Aplicațiile timpurii includ boli genetice rare și cancer. Aceeași abordare va ajuta la implementarea pe scară largă a profilării riscurilor, la depistarea precoce a unor boli, pe măsură ce cercetarea medicală evoluează pentru a cuprinde medicina de precizie. Această tehnologie este utilizată și cercetată pentru secvențierea virusului SARS-CoV-2 (COVID-19) și a variantelor sale.

Ce este genomul uman?

Genomul este materialul genetic al organismului, format din ADN care include atât genele (elemente codificatoare), cât și secvențele necodificatoare [1].

Acidul dezoxiribonucleic

Acidul dezoxiribonucleic (sau ADN) este materialul genetic care este prezent în aproape fiecare celulă din corpul unei persoane, fiind localizat în nucleu și mitocondrii. Mitocondriile sunt responsabile pentru transformarea energiei din alimente într-o formă ușor de utilizat pentru celule [2].

Molecula de ADN conține 4 baze azotate, respectiv adenină (A), guanină (G), citozină (C) și timină (T). La om, ADN-ul conține aproximativ 3 miliarde de baze. Structura ADN-ului este unică și diferită de la persoană la persoană.

Secvențierea ADN-ului

ADN-ul este alcătuit din nucleotide. În cadrul ADN-ului dublu catenar, bazele din ADN-ul monocatenar vor forma perechi cu bazele de pe celălalt ADN. Această împerechere are loc datorită legăturilor de hidrogen care se formează între baze complementare [3].

În ADN, bazele sunt citozina (C), timina (T), adenina (A) și guanina (G). În ADN-ul dublu catenar, adenina, timina, citozina, guanina vor forma legături între ele și, prin urmare, vor forma perechi de baze. Când aceste legături s-au format, va rezulta structura clasică, dublă helică.

Secvențierea ADN-ului poate dezvălui o mulțime de informații genetice, ajutând la identificarea genelor care codifică proteinele, instrucțiuni care pot determina genele să se activeze sau să se oprească, precum și la cercetarea mutațiilor care pot provoca boli.

La sfârșitul anilor 1970, secvențierea a fost posibilă, deși este încă dificilă, prin introducerea metodei de degradare chimică a lui Maxam și Gilbert și a metodei Sanger de secvențiere. Aceasta din urmă s-a dovedit a fi mai utilă și, timp de aproape trei decenii, a devenit tehnica dominantă de secvențiere a ADN-ului, fiind și acum considerată de mulți drept „etalonul de aur” [1].

Finalizarea primelor schițe ale genomului uman a fost doar începutul erei moderne de secvențiere a ADN-ului, care a dus la o invenție ulterioară, stimularea dezvoltării unor noi strategii avansate, pentru secvențierea de mare viteză a ADN-ului, așa-numita „generație viitoare privind metodele de secvențiere”.

Anul 2011 a fost sărbătorit ca a 10-a aniversare de când genomul uman a fost secvențiat pentru prima dată. În această perioadă, s-a obținut un succes extraordinar în domeniul decodificării genomului uman, avansarea tehnologică a noii ere a utilizărilor genomului uman, către genomuri personalizate și descoperirea variantelor rare, valorificarea secvențierii genomului pentru a avea impact asupra cercetărilor cancerului și asupra evoluției și populației mamiferelor [5].

Astăzi, se adoptă o abordare mai globală, care a dat naștere domeniului biologiei sistemelor, prin coroborarea cercetării biologice cu cea medicală.

Tehnici de secvențiere a ADN-ului

În 1977, Frederick Sanger a dezvoltat o nouă metodă de secvențiere a ADN-ului, bazată pe metoda de terminare a lanțului, în care nucleotidele dintr-o moleculă de ADN monocatenar sunt determinate prin sinteza complementară a lanțurilor polinucleotidice. În prezent, această metodă este încă cunoscută sub numele de „metoda Sanger de secvențiere a ADN-ului”, devenind o metodă standard în genetica clinică [2].

Tehnicile de secvențiere de nouă generație (NGS), cunoscute și sub numele de secvențiere masivă paralelă, cu randament ridicat sau profund, înlocuiesc treptat metoda tradițională Sanger ca metodă de primă alegere.

În principiu, conceptele din spatele tehnologiilor Sanger vs. Secvențierea de generație următoare sunt similare. Atât în ​​secvențierea de nouă generație, cât și în cea Sanger, ADN polimeraza adaugă nucleotide fluorescente, una câte una, pe firul unui șablon de ADN în creștere. Fiecare nucleotidă încorporată este identificată prin eticheta sa fluorescentă.

Diferența critică dintre secvențierea Sanger și secvențierea de nouă generație este secvențierea volumului. În timp ce în metoda Sanger, secvențierea se face doar pe un singur fragment de ADN, la un moment dat, secvențierea de nouă generație este masiv paralelă, secvențând milioane de fragmente simultan, pe parcurs. Acest proces cu randament ridicat se traduce prin secvențierea a sute de mii de gene la un moment dat. Secvențierea de nouă generație oferă, de asemenea, un grad mai mare de descoperire pentru a detecta variante noi sau rare, folosind secvențierea profundă [5].

Secvențierea Sanger poate fi o alegere bună atunci când se testează o mică regiune de ADN, pe un număr limitat de probe sau ținte genomice (cel mult ~20). În caz contrar, este mai probabil ca secvențierea de nouă generație să fie o alegere mai bună.

Secvențierea de nouă generație permite examinarea mai multor eșantioane în mod rentabil și detectarea mai multor variante, în zonele vizate ale genomului – o abordare care ar fi costisitoare și de prea lungă durată dacă s-ar folosi secvențierea Sanger [6].

Prima generație de tehnici de secvențiere

Secvențierea Sanger este o tehnică de secvențiere țintită, care folosește primeri oligonucleotidici pentru a căuta regiuni specifice ale ADN-ului.

Secvențierea Sanger este o metodă care oferă informații despre identitatea și ordinea celor patru baze nucleotidice dintr-un segment de ADN. De asemenea, cunoscută și sub denumirea de „metodă de terminare a lanțului”, oferă un grad ridicat de precizie, capacități de citire lungă și flexibilitate, pentru a susține o gamă variată de utilizări, în multe domenii de cercetare.

Tehnologia de secvențiere Sanger este foarte utilă pentru aplicații în care nu este necesar un randament ridicat.

A doua generație de tehnici de secvențiere

Termenul de  „secvențiere de generație nouă” a implicat dezvoltarea tehnologiei de secvențiere a ADN-ului. A doua generație implică tehnologia automată a mașinilor de secvențiat [2].

Metodele de secvențiere de a doua generație pot fi grupate în două mari categorii, secvențierea prin hibridizare și secvențierea prin sinteză. Metodele secvențierii prin sinteză reprezintă o dezvoltare ulterioară a secvențierii Sanger, în combinație cu cicluri repetate de sinteză, imagistică și metode de încorporare a nucleotidelor suplimentare în lanțul în creștere.

La prima vedere, aceste noi metode pot părea scumpe, dar reacțiile se desfășoară în paralel, adesea la volume de nanolitri, picolitri sau zeptolitri, în camere mici, și, astfel, costul perechii de baze secvențiate este nominal. Rafinările continue și miniaturizarea reduc și mai mult costurile.

Secvențierea prin hibridizare

Această metodă a fost dezvoltată inițial în anii 1980, folosind oligonucleotide ADN în serie, cu secvență cunoscută, pe filtre care au fost hibridizate cu fragmente marcate de ADN. Hibridizând și spălând în mod repetat ADN-ul nehibridizat nedorit, a fost posibilă determinarea fragmentelor marcate hibridizante, care corespundeau cu secvența sondelor ADN de pe filtru.

Astfel, a fost posibilă construcția informațiilor de secvență contigue mai mari, pe baza informațiilor suprapuse din punctele de hibridizare a sondei. Secvențierea prin hibridizare a fost în mare parte legată de tehnologii care depind de utilizarea sondelor specifice pentru interogarea secvențelor, cum ar fi în aplicațiile de diagnostic pentru identificarea polimorfismelor monocelotidice [7].

Secvențierea prin sinteză

Metodele de secvențiere prin sinteză au adoptat mai multe abordări distincte. Metodele de „a doua generație” utilizează, în general, un suport solid care conține micro-canale, în care apar reacțiile de secvențiere.

Metodele actuale diferă de abordarea secvențierii originale Sanger prin faptul că se bazează pe citiri mult mai scurte (în prezent, până la aproximativ 300 – 500 de baze). Mai mult, ele au, în general, o rată de eroare intrinsec mai mare, în raport cu secvențierea Sanger, și se bazează pe o acoperire de secvență ridicată („secvențiere masivă paralelă”), de milioane până la miliarde de secvențe scurte de ADN citite (50 – 300 de nucleotide), ca o modalitate de a obține o precizie bazată pe identificarea unei secvențe de consens [8].

Ca și metode de secvențiere prin sinteză, enumerăm Pirosecvențierea, Secvențierea Ion Torrent și Illumina.

Pirosecvențierea 454

Pirosecvențierea 454 este o metodă de secvențiere a ADN-ului cu randament ridicat, care utilizează o singură catenă de ADN cu o lungime de 400 – 500 bp. Catena unică este utilizată ca șablon pentru a sintetiza secvența catenei sale complementare, care este determinată de un lanț de reacții ce rezultă în emiterea luminii, atunci când o secvență complementară adaugă o nucleotidă specifică sau o lungime de nucleotide.

Această metodă a fost dezvoltată inițial la Institutul Regal de Tehnologie din Stockholm, Suedia, în 1996. Metoda bazată pe matrice permite secvențierea unui întreg genom uman în ~27 de zile [4].

Pirosecvențierea 454 a fost întreruptă în 2013, deși reactivii sunt încă disponibili de la mai mulți furnizori. Tehnologia Pirosecvențierii 454 a fost utilizată, în mod obișnuit, pentru secvențierea genomului și datorită lungimilor de citire lungi, care sunt realizate în mod obișnuit, și a randamentului relativ ridicat (25 de milioane de baze, la o precizie de minimum 99%, într-un interval de 4 ore), facilitând asamblarea genomului [1].

Secvențierea Ion Torrent

Tehnologia Ion Torrent convertește direct secvența nucleotidelor în informații digitale, pe un cip semiconductor.

Tehnologia Ion Torrent funcționează pe principiul detectării eliberării ionilor de hidrogen, în timpul încorporării unor noi nucleotide în șablonul de ADN în creștere.

Ion Torrent combină software-ul computerului cu circuite integrate și semiconductori complementari de oxid de metal, folosiți în camerele digitale, computerele laptop și telefoanele mobile. Tehnologia adoptă, de asemenea, un sistem de detectare electrochimică numit „tranzistoare cu efect de câmp sensibil la ioni”, care poate detecta ionii pe măsură ce sunt eliberați de ADN polimerază, în timpul secvențierii prin sinteza ADN.

Toate aceste electronice sunt axate pe detectarea și analiza eliberării unui ion hidrogen (sau proton), care are loc de fiecare dată când se adaugă un nucleotid trifosfat. Eliberarea protonului determină o ușoară schimbare a pH-ului, care este detectată de un senzor [8].

Un avantaj major al sistemului este că nu este nevoie de cameră, sursă de lumină sau scaner; încorporarea nucleotidelor este convertită direct în tensiune, care este înregistrată direct, accelerând foarte mult procesul.

Illumina

De departe, cel mai important jucător din secvențierea de a doua generație este Illumina, folosind tehnologia dezvoltată pentru prima dată de Solexa și Lynx Therapeutics. Secvențierea Illumina se bazează pe o tehnică cunoscută sub numele de „amplificare de punte”, în care moleculele ADN cu adaptoare corespunzătoare, ligate la fiecare capăt, sunt utilizate ca substraturi pentru reacții de sinteză pentru amplificare, repetate pe un suport solid (lamă de sticlă), care conține secvențe oligonucleotidice complementare la un adaptor ligat.

Oligonucleotidele de pe lamă sunt distanțate astfel încât ADN-ul, care este apoi supus unor runde repetate de amplificare, creează „clustere” clonale, formate din aproximativ 1.000 de copii ale fiecărui fragment de oligonucleotidă. Fiecare lamă de sticlă poate suporta milioane de reacții paralele de cluster. În timpul reacțiilor de sinteză, nucleotidele modificate proprietare, corespunzătoare fiecăreia dintre cele patru baze, fiecare cu o etichetă fluorescentă diferită, sunt încorporate și apoi detectate.

De asemenea, nucleotidele acționează ca terminatori ai sintezei pentru fiecare reacție, care sunt deblocați după detectare, pentru următoarea rundă de sinteză. Reacțiile se repetă timp de cel puțin 300 de runde. Utilizarea detecției fluorescente crește viteza de detecție datorită imaginii directe, spre deosebire de imagistica bazată pe cameră [2].

O problemă care poate apărea la secvențierea Illumina este lipsa de sincronizare în reacțiile de sinteză dintre membrii individuali ai unui cluster, interferând cu generarea unei secvențe consens exacte și reducând numărul de cicluri care pot fi efectuate.

A treia generație de tehnici de secvențiere

Spre deosebire de metodele de secvențiere de a doua generație, metodele de secvențiere de a treia generație urmăresc secvențierea moleculelor lungi de ADN (și ARN). Actualul lider tehnologic comercializat în acest domeniu este Pacific Biosciences (PacBio). Metoda mai poartă numele de „secvențierea în timp real a unei singure molecule” [5].

Pregătirea șablonului este unică în procesul PacBio, deoarece implică producerea unei molecule circulare de ADN dublu catenar, cu o secvență cunoscută, complementară primerilor utilizați pentru inițierea sintezei ADN pe șablon.

Un avantaj important al procesului de imagistică și detectare a secvențierii în timp real PacBio este că viteza fiecărei adiții de nucleotide în timpul sintezei poate fi măsurată.

Secvențierea Nanopore

Aceste secvențieri utilizează nanopori proteici, într-o membrană polimerică rezistentă electric, prin care apar modificări electrice caracteristice, pe măsură ce fiecare nucleotidă trece prin detector.

Spre deosebire de toate secvențierele ADN menționate mai sus, secvențierea unei molecule de ADN cu ajutorul secvențierului ADN Nanopore nu conține marcarea și detectarea nucleotidelor. Această tehnică a fost dezvoltată în urma studiilor privind translocarea ADN-ului prin diferiți nanopori artificiali.

Secvențierea ADN cu instrumentul Nanopore se bazează pe conversia semnalului electric al nucleotidelor, prin trecerea printr-un nanopor. Principiul acestei tehnici se bazează pe modularea curentului ionic prin por, pe măsură ce o moleculă de ADN îl traversează, dezvăluind caracteristicile și parametrii (diametrul, lungimea și conformația) moleculei [1].

Aceste tehnologii ajută la secvențierea de  molecule de ADN de până la 100.000 de nucleotide, într-un interval de câteva ore, însă au o rată de eroare ridicată (între 5% și 30%).

Comparație între tehnici

Spre deosebire de a doua tehnologie, care se bazează pe PCR pentru a crește clusterele unui șablon de ADN dat, atașând clusterele de șabloane de ADN la o suprafață solidă, care este ulterior reprezentată pe măsură ce clusterele sunt secvențiate prin sinteză într-o abordare etapizată, a treia tehnologie interoghează molecule unice de ADN în așa fel încât nu este necesară nicio sincronizare, depășind astfel problemele legate de prejudecățile introduse prin amplificarea și defazarea PCR.

Mai mult, a treia tehnologie are potențialul de a exploata mai profund, ratele catalitice ridicate și procesivitatea ridicată a ADN polimerazei, sau de a evita orice biologie sau chimie pentru a prelungi radical citirea (de la zeci de baze, la zeci de mii de baze pentru fiecare citire) și a reduce durata de așteptare până la obținerea rezultatului (de la zile, la ore sau minute).

În afară de aceasta, a treia tehnologie poate oferi următoarele avantaje față de a doua tehnologie de secvențiere: i) randament mai mare, ii) timp de răspuns mai rapid, iii) lungimi mai mari de citire, iv) precizie mai mare pentru a permite detectarea variantelor rare, v) cantități mici de materie primă (teoretic, poate fi necesară doar o singură moleculă pentru secvențiere) și vi) cost redus [9].

Totuși, momentan, tehnicile de secvențiere de generația a treia au o rată de eroare ridicată (între 5% și 30% dintre nucleotide sunt raportate ca fiind greșite).

Prin comparație cu platforma Sanger, metodele de secvențiere de generație următoare generează citiri mai scurte, cu o calitate mai slabă. Reducerea lungimii și calității citirii a necesitat dezvoltarea instrumentelor de bioinformatică, pentru a ajuta fie la cartografierea acestor citiri mai scurte la secvențele de referință, fie la asamblarea de novo.

Dezvoltarea acestor noi tehnici vizează satisfacerea cererii de informații secvențiale în diferite domenii de cercetare, cum ar fi studiul genomicii și evoluției, criminalistică, epidemiologie și diagnostic, precum și terapie aplicată.

Concluzii

La cel mai fundamental nivel, secvențierea ADN-ului este felul prin care formele de viață terestre pot fi definite și diferențiate între ele. Prin urmare, în ultima jumătate de secol, mulți cercetători din întreaga lume au investit mult timp și resurse pentru dezvoltarea și îmbunătățirea tehnologiilor care stau la baza secvențierii ADN-ului. În fiecare etapă de secvențiere, datele trebuie să fie mapate și aliniate, astfel încât fluxurile de lucru variate să poată accesa datele rapid și eficient.

Cercetătorii ar putea produce secvențe care ar putea avea o lungime care să cuprindă de la o duzină la o sută de nucleotide.

De-a lungul anilor, inovațiile în protocoalele de secvențiere, biologia moleculară și automatizarea au crescut capacitățile tehnologice ale secvențierii, în timp ce au scăzut costul, permițând citirea ADN-ului sutelor de perechi de nucleotide, pentru a produce baze de date
într-o singură etapă. Cercetătorii s-au mutat de la laborator la computer, de la manipularea segmentelor de ADN, la rularea codului.

Genomurile au fost decodate, companiile au început – și adesea, mai târziu, s-au dizolvat – cu baze de date privind secvențierea ADN tot mai comprehensivă. Prin urmare, secvențierea ADN – în multe privințe o disciplină de cercetare relativ recentă și cu multiple aplicații viitoare – are o istorie bogată. Înțelegerea acesteia poate să ofere aprecierea metodologiilor actuale și noi perspective pentru viitor, deoarece lecțiile învățate în etapa precedentă pot modela generațiile următoare.

Pentru ABONAMENTE și CREDITE DE SPECIALITATE click AICI!

Referințe bibliografice:

  1. Stranneheim H., Lundeberg J. Stepping stones in DNA sequencing. Biotechnol. J. 2012 Sept.;7(9):1063–73;
  2. Dewey F. E., Pan S., Wheeler M. T., Quake S. R., Ashley E. A. DNA sequencing: Clinical applications of new DNA sequencing technologies. Circulation. 2012 Febr. 21;125(7):931–44;
  3. Graham C. A., Hill A. J. Introduction to DNA sequencing. Methods Mol. Biol. Clifton N. J. 2001;167:1–12;
  4. Pareek C. S., Smoczynski R., Tretyn A. Sequencing technologies and genome sequencing. J. Appl. Genet. 2011;52(4):413–35;
  5. França L., Carrilho E., Kist T. A review of DNA sequencing techniques. Q. Rev. Biophys. 2002 Jun. 1;35:169–200;
  6. Lehrach H. DNA sequencing methods in human genetics and disease research. F1000Prime Rep. 2013 Sept. 2;5:34;
  7. Koboldt D. C., Steinberg K. M., Larson D. E., Wilson R. K., Mardis E. The Next-Generation Sequencing Revolution and Its Impact on Genomics. Cell. 2013 Sept. 26;155(1):27–38;
  8. Slatko B. E., Gardner A. F., Ausubel F. M. Overview of Next Generation Sequencing Technologies. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2018 Apr.;122(1):e59;
  9. Robin J. D., Ludlow A. T., LaRanger R., Wright W. E., Shay J. W. Comparison of DNA Quantification Methods for Next Generation Sequencing. Sci. Rep. 2016 Apr. 6;6(1):24067.

asistent cercetare generală

Cuvinte-cheie: , , ,

Fii conectat la noutățile și descoperirile din domeniul medico-farmaceutic!

Utilizam datele tale in scopul corespondentei si pentru comunicari comerciale. Pentru a citi mai multe informatii apasa aici.




    Comentarii

    Utilizam datele tale in scopul corespondentei. Pentru a citi mai multe informatii apasa aici.